Опыт 1. Сопоставление окислительно-восстановительных потенциалов рибофлавина.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

Реактивы. 1. Дистиллированная вода.

2. Рибофлавин, 0,025%-ный раствор.

3. Метиленовая синь, 0,01%-ный раствор.

4. Соляная кислота, концентрированная.

Для исследования окислительно-восстановительных потен­циалов применяют индикаторы, имеющие свой цвет при оп­ределенном значении этого потенциала.

1. В пробирку с 0,5 мл воды добавьте 3 капли взвеси рибофлавина (0,025% раствор) и по каплям 0,01% раствор метиленового синего до появления синего или сине-зеле­ного окрашивания.

2. Внесите в пробирку кусочек цинка и 2-3 капли концентрированной НСl. Отметьте постепенное изменение окраски.

3. Бледно-желтую жидкость слейте в широкую пробирку. Оцените цвет жидкости в пробирке через 10-15 минут.

Объясните наблюдаемые явления. Роль какого компонента дыхательной цепи клетки в этом модельном опыте выполняет метиленовый синий?

Опыт 2. Открытие альдегиддегидрогеназы в молоке.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Водяная баня.

4. Пробки.

Реактивы. 1. Молоко, кипяченое и некипяченое.

2. Формалин, 0,4%-ный раствор.

3. Метиленовая синь, 0,01%-ный раствор.

1. Налейте в две пробирки по 3 мл молока из пронумерованных колбочек соответственно (в одной из них молоко кипяченое, в другой - нет).

2. В обе про­бирки внесите по 6 капель 0,4%-ного раствора формальдегида и несколько капель 0,01%-ного раствора метиленовой сини (до появления голубого окрашивания).

3. Пробирки встряхните и быстро закройте пробками для того, чтобы создать относительно анаэробные условия.

4. Поместите пробирки в водяную баню (37^оС) и отметьте постепенное обесцвечивание метиленовой сини через 5-10 минут в одной из пробирок.

5. После обесцвечивания содержимое пробирки несколько раз встряхните и наблюдайте за изменением цвета.

Определите, в какой пробирке содержалось некипяченое молоко? Объясните, почему Вы сделали такой вывод? Почему после встряхивания обесцвеченной пробирки произошло изменение цвета?

Опыт 3. Качественное определение креатинина в мышцах.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Газовая горелка.

4. Держатели для пробирок.

Реактивы. 1. Мышечная ткань.

2. Пикриновая кислота, насыщенный раствор.

3. Гидроксид натрия, 10%-ный раствор.

1. Разотрите в ступке 5 гр мышечной ткани.

2. Добавьте примерно 20 мл воды и отфильтруйте через бумажный фильтр.

3. К полученному прозрачному фильтрату мышечной ткани добавьте равный объем трихлоруксусной кислоты до выпадения осадка белков и вновь отфильтруйте раствор через бумажный фильтр.

4. К 1-2 мл фильтрата мышечной ткани, свободного от белков, добавьте 3 капли насыщенного раствора пикриновой кислоты (ядовита!).

5. Проведите подщелачивание раствора добавлением нескольких капель 10%-ного гидроксида натрия. Через несколько минут появляется оранжево-красная окраска. Температура ускоряет реакцию.

6. Проделайте опыт с фильтратами красных и белых мышечных волокон.

7. Сделайте вывод о содержании креатинина в разных мышцах и причинах, обуславливающих это различие.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Занятие № 9. «Цикл трикарбоновых кислот»

Цель занятия: изучить механизм некоторых реакций цикла Кребса. Освоить метод количественного определения пировиноградной кислоты в моче.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1. Окислительное декарбоксилирование пирувата как предварительный этап цикла лимонной кислоты. Перечислите витамины и коферменты, задействованные в этом процессе.

2. Реакции цикла лимонной кислоты. Что определяет общее направление реакций в цикле? В какой части клетки протекает этот процесс? Почему?

3. Какие коферменты и витамины участвуют в цикле Кребса? Объясните, как они работают, с указанием конкретных реакций.

4. Расскажите о реакциях цикла Кребса, в результате которых образуются НAДH₂ и ФAДН₂. Какова дальнейшая судьба этих соединений?

5. Функции цикла трикарбоновых кислот. Объясните, какое значение для цикла лимонной кислоты имеет анаплеротическая реакция?

6. Энергетический выход цикла трикарбоновых кислот. Сколько молекул ATФ образуется в ходе оборота через цикл одной молекулы лимонной кислоты? Все ли молекулы ATФ, образующиеся при полном окислении активного ацетила, синтезируются путем окислительного фосфорилирования. Как регулируется скорость цикла?

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Экспериментальная работа.

Одним из методов количественного анализа в биохимии является фотокалориметрия. Метод основан на измерении оптической плотности окрашенных растворов, которые получают при взаимодействии субстрата с различными химическими агентами. Концентрация субстрата пропорциональна степени окрашивания раствора.