Вирустық инфекциялардың лабораторлық диагностикасының принциптері Зерттеу әдістері.

1. Вирусологиялық әдіс – патологиялық материалдағы вирусты анықтау.
2. Серологиялық әдіс – аурудың қан сарысуынан вирусқа қарсы антиденелерді анықтау.
3. Вирустық инфекциялардың экспресс-диагностикасы: жылдамдатылған серологиялық және вирусоскопиялық әдіс.

Әдістер	Зерттеу мақсаты
Вирусологиялық әдіс	Вирусты биологиялық сезімтал обьектілерден НР, РТГА, РТГ, ИФА, РИФ, РИА, РСК және басқа да реакциялар арқылы анықтайды.
Серодиагностика	Вирустарға қарсы қан сарысуындағы антиденелер титрін НР, РТГА, РИФ, ИФА, РИА, РСК реакциялары арқылы анықтайды.
Экспресс-диагностика	Клиникалық материалда вирус бөлшектерін немесе вирус спецификалық антигендерді РИФ, ИФА, РИА, ЭМ, ИЭМ және басқа да реакциялар арқылы анықтайды.

Вирусологиялық зерттеу әдісі 2 кезеңнен тұрады:

А) клиникалық материалдан вирустарды бөліп шығару.

Б) бөлінген вирустардың түрлерін анықтау немесе салыстыру.

Вирусты анықтау үшін алынатын зерттеу материалы әртүрлі болады, ол инфекциялық процестің динамикасына және вирустың тропизміне байланысты. Мысалы: тұмау немесе ұшық болса жұтқыншақтан бөлінетін шырыш, везикуладан қырып алынған материал, жұлын сұйығы, ЖИТС инфекциясында Т-лимфоциттердің субпопуляциясы, қан сарысуы, сперма; құтыру ауруында зақымдалған адамның сілекейі және өлгендердің ми тіндері, сілекейдегі бөлінділері зерттеледі.

Вирусты анықтау мақсатында патологиялық материалмен сезімтал лабораториялық жануарларды, тауық эмбриондарын және торша өсіндісіне жұқтырады: Мысалы: тұмау инфекциясында вирус бар материалды торша өсіндісіне егіп немесе күзендер мен тышқандардың мұрын қуысы арқылы жұқтыруға болады. Ол тауық эмбрионының аллантоис немесе амнион қуыстарына енгізу арқылы жұқтыруы ең тиімдісі. ЖИТС кезінде тек қана торша өсіндісінің яғни Т-хелпер пайдаланылады. Вирус лимфоциттер және макрофагтар сирек қолданылады, бұл торшалардың ішінде вирус репродукциясының активтілігі төмен; ұшық инфекциясы кезінде вирусты өсіру үшін торша өсіндісі немесе лабораториялық жануарлар қолданылады. Үй қоянын және тышқандарды құтыру инфекциясын дәлелдеу үшін де қолданылады.

Вирусологиялық зерттеуде біркелкі жануарларды пайдаланған дұрыс. Өйткені олардың генотиптік және фенотиптік қасиеттері ұқсас инфекцияға өте сезімтал.

Патологиялық материалда вирус болған кезде жануарларда инфекциялық аурулардың клиникалық белгілері мен өзгерістері пайда болады. Мысалы: ұшық инфекциясымен құрсақ ішіне зақымдалған тышқандар 3-4 күннен кейін өледі. Егер материалды үй қоянының немесе теңіз шошқысының көзінің мөлдір қабатына жұқтырса, онда қабыну процесі – кератоконьюктивит пайда болады. Құтыру вирусымен зақымдалған тышқандардың аяқ-қолдары жансызданады да өледі. Тауық эмбрионының қабықтарын, аллантоис, амнион қуыстарында вирустың көбейгенінен эмбрион тұқымы зақымданып одан әрі өсуі тоқтатылады. Зақымдалған эмбрионда мынадай өзгерістер байқалады:

1. ақ дақтар – хорион-аллантоистық қабықтағы төмпешіктердің пішіні мен мөлшері өзгереді (тұмау, шешек вирустары), амнион қабығында патоморфологиялық өзгерістер және эмбрионның өлуі.
2. көзге көрінетін өзгерістер болмаса вирусты анықтау үшін тауық эмбрионының аллантоис немесе амнион қуыстарының сұйығымен гемагглютинация реакциясы –РГА қойылады. Көбінесе ажырасқан аллантоис қуысындағы сұйықтарға бірдей көлемде 1% тауық эритроциттері қосылады. Аллантоис қуысындағы сұйықтағы вирустар әсерімен байланысты эритроциттердің агглютинациясы микропланшеттер лункасының түбінде «қол шатыр (зонтик)» тәрізді анықталады. Агглютинация жоқ кезде – эритроциттер лунка түбінде – «түйме» тәрізді орналасады.

Торша өсіндісіндегі патоморфологиялық өзгерістері мынадай: вирустар репродукциясы ядроның немесе цитоплазманың құрылымдарын зақымдап өзгертеді немесе торшаны жансыздандырады. Сондықтан, микроскоп арқылы вирус зақымданған торшада мына өзгерістерді анықтауға болады:

1. Торша ішіне тән патоморфологиялық өзгерістер. Мысалға, құтыру ауруында нейрондардың цитоплазмасында Бабеш-Негри денешіктері анықталады, шешек ауруында – көздің мөлдір қабығының эпителиальдық торшаларының цитоплазмасында – Гварниери денелері, аденовирустық және ұшық инфекцияларында зақымдалған торшалардың ядросында қосындылар анықталады. Бұл қосындылар вирус бөліктері жинақталуы немесе оның компоненттерінің торша материалдарымен жиналуы;
2. вирустың цитопатиялық әсерінен торшаның ісінуі, солуы немесе торшаның дегенеративті өзгеруі қабығының деструкциясымен байқалады. Өлген торшалар адгезивтік қасиетінен айырылып шынының бетінен түсіп қалады. Сондықтан бір қабатты торша өсіндісінде біркелкі торшалардың арасында «алаңдар» немесе бос орындар көрінеді. Симпластар (синцитий) – көп ядролық аз өмір сүретін торшалар вирустардың цитопатиялық әсерінің ерекше белгісі деп саналады, олар ЖИТС, қызылша инфекцияларына тән.
3. зақымдалған торша ішіндегі вирустар гемадсорбция – Ргадс реакциясы арқылы анықталады. Вирустық компоненттер, оның ішінде эритроциттерді агглютинациялайтын гемагглютининдер зақымдалған торшаның мембранасына бекінеді. Сондықтан вирустармен зақымдалған торшалық суспензияға қосылған эритроциттердің 1% қоспасы торша мембранасына адсорбцияланады. Мұндай құбылыс тұмау, қызылша, шешек, аденовирустық және басқа инфекцияларда байқалады. Вирустармен зақымдалған торшалардың гемадсорбциялық қасиеті цитопатиялық өзгерістерден бұрын пайда болады, сондықтангемадсорбция реакциясын вирусты ерте анықтау үшін пайдалануға болады:
4. бляшкалар әдісі, бұл вирустың цитопатиялық әсерін байқау модификациясы. Вирус әсерімен байланысты бір қабатты торша өсіндісінің дөңгелек сияқты бүліншегін бляшкалар деп атайды. Бұл әдісте бір қабатты торшаларды вирустардың аз концентрациясымен зақымдайды және торша бетіндегі вирустық бөлшектерін агармен ұстатады (фиксация), ал агарға витальді бояғыш – нейтральды қызыл қосылған. Бұл жағдайда вирустардың цитопатиялық әсері бір жерге топталған, ал өлген торшалар бояуды ұстау қасиетін жоғалтып түссізденеді. Соның әсерінен бір қабатты торшалардың мөлдір емес қызғылт фонында айқын бляшкалар пайда болады. Олар мөлдір, түссіз дөңгелек таңба сияқты болады. Полимиелит, шешек, қызылша және басқа да инфекцияларды анықтау үшін осы әдіс қолданылады:
5. түрлі-түсті сынама тіндік торшаларды өсіру үшін қолданылады Игла, 199 орталар құрамында қоректік заттармен қатар индикатор – фенолрот болады, егер рН-7,4-7,6 дәрежесінде болса қызыл түсті береді. Қоректік ортада ұлғайып көбейген торшалар зат алмасуы нәтижесінде қышқыл заттарды бөліп шығарады. Бөл себептен қоректік ортаның рН 6,9-7,0 дейін төмендегеннен кейін индикатордың яғни қоректік ортаның түсі қызылдан сарыға өзгереді. Егер қоректік ортадағы торша өсіндісі және вирус – құрайтын материал бір мезгілде кіргізілсе вирустар торшаны зақымдап, дегенеративтік өзгеріс туғызады немесе торшалар жансызданады. Сондықтан метоболиттік процестер тоқталып рН өзгермейді және орта түсі қызыл болып қалады, яғни түрлі-түсті сынама нәтижелі болды деп саналады.

Салыстыру (идентификация)

Вирус түрін салыстырып анықтау жолы лаборатория жануарларында нейтралдау реакциясы арқылы жүреді, бірақ бұл әдіс сирек қолданылады. Бұл үшін экспериментальді жануар ағзасына зерттелетін вирус және вирус нейтралдайтын антиденелер бар түрлі спецификалық сарысу қоспасы әртүрлі әдісімен енгізеді. Егер жануарлар ауырмаса, онда вирустардың антиденелермен нейтралдауын байқатады. Белгілі спецификалық антиденелер арқылы вирустың типі анықталады.

Вирустың нозологиялық тәндігі, тауық эмбрионында бөлінген және РГА реакциясында білінген гемагглютинацияны тежеу реакциясымен (РГТА) анықталады. Гемагглютининдердің эритроциттерді агглютинациялау қасиетіне РГА реакциясы негізделген. Бірақ вирусты, құрамында вирусқа бекітілген белоктарды нейтралдайтын антиденелер бар иммунды сарысуымен алдын-ала қосып, кейін эритроциттерді қосса гемагглютинация реакциясы байқалмайды – эритроциттер «түйме» тәрізденіп шұңқыр түбіне тұнады. Бұл жағдай гемагглютинацияны тежеу реакциясын (РТГА) нәтижелі деп саналады. РГА – бұл физика-химиялық реакция, ал РТГА – иммунологиялық реакцияның бір түрі – нейтралдау реакциясы. РТГА реакциясын тек қана вирустың түрін анықтағанда емес, сондай-ақ вирус спецификалық антиденелерді және олардың титрін қан сарысуында айқындауға қолданылады.

Нейтралдау реакциясы торша өсіндісіндегі вирустың идентификациясын өткізгенде қолданылады:

1. нейтралдау реакциясында түрлі-түсті сынама қолданылады. Түрлі-түсті сынаманы өткізу үшін белгілі компонент – торша өсіндісіне (Игла немесе 199 қоректік орта) және вирусты материал түріне спецификалық сарысу қолданылады. Вирустың бөліктері антиденелермен нейтралданса бұл реакция нәтижелі деп саналады. Тіндік торшалар вирустармен зақымданбай өмір сүруге бейім қалпында қалса, олардың зат алмасуынан қышқыл заттар пайда болады. Сондықтан қоректік ортада рН төмендейді және оның қызыл түсі сарыға ауысады:

2. цитопатиялық әсерге байланысты нейтралдау реакциясы. Реакция компоненттері: бір қабатты торша өсіндісі, вирус құрайтын материал және белгілі түрге спецификалық сарысу. Вирустық антигендер антиденелермен нейтрализациялағанда тіндік торшалары бұзылмай қалады. Сондықтан, микроскопта цитопатиялық өзгеріс жоқ, мұндай реакция нәтижелі деп саналады.

3. вирустарда «бляшка» әдісімен үқсастыру және оларды анықтау. Бұл әдіс цитопатиялық әсерлі нейтрализация реакциясының модификациясы болып табылады. Реакция нәтижелі болғанда – дегенеративтік өзгерістер – бляшкалар бір қабатты торшаларда болмайды:

4. гемадсорбцияны тежеу реакциясында вирус нейтралдау антиденелер арқылы вирус түрлерін анықауға болады. Егер бір қабатты торшаларға зерттелетін вирус құрайтын материалды және белгілі түрге спецификалық сарысу енгізгеннен кейін қосылған эритроциттер тіндік торшалар бетіне адсорбцияланбаса, онда реакция нәтижелі деп саналады. Себебі, антиденелер вирустық бөліктерді нейтралдайды, тіндік торшалар зақымдалмайды және олардың сыртқы мембранасында вирустық гемагглютининдер жоқ. Сондықтан эритроциттер тіндік торшалардың мембранасында жиналмайды, гемадсорбция тежеледі. Теріс реакция кезінде антигендермен антиденелердің сәйкестігі болмағанда вирустар тіндік өсіндіні зақымдайды, торшалы мембранаға гемагглютининдер бекітіліп эритроциттер торша маңына жиналады.

Серологиялық зерттеу кезінде антиденелердің титрін анықтау үшін сырқаттың қан сарысуы екі рет 7-10 күн аралығында қайталап тексереді. Қайталап қан сарысуын зерттеудің қажеттілігі мынау: Вирусқа қарсы антиденелердің титрі бірінші рет зерттелген қанда вакцинация немесе ертеде болған жүқпалы аурумен байланысты болуы мүмкін. Егер инфекция динамикасында антиденелердің титрі жоғарыласа ол айтарлықтай дәлел. Антиденелердің титрін 4 есе жоғарылағаны вирустық инфекцияны дәлелдейді.

Серологиялық зерттеу жабдықтары: 1. зерттелетін қан сарысуы, яғни онда вирус нейтралдайтын антиденелерді анықтау; 2. белгілі вирус спецификалық антигендер немесе вирус бөліктері; 3. бұл биологиялық обьект одан жоғарыда көрсеткен зерттелетін қан сарысуының және белгілі вирус бөліктерінің өзара қатынасуын, яғни нейтрализация реакциясының нәтижесін көреміз. Обьект ретінде лабораториялық жануарлар, тауық эмбриондары және торша өсінділері болуы мүмкін. Оң реакция кезінде түрге спецификалық антиденелер, зерттелетін қан сарысуындағы вирустарды нейтралдайды, сондықтан:

1. лабораториялық жануарлар ауырмайды, әрі өлмейді.

2. тауық эмбриондары да патологиялық өзгеріссіз болмайды;

3. бір қабатты торша өсіндісінде ЦПӘ, бляшкалар, гемадсорбция байқалмайды. Торша тіндік өсіндісінде интактілі болып қалады. Түрлі-түсті сынама торша суспензиясының өмір сүру бейімділігін дәлелдейді (қоректік ортаның түсі сары), зерттелген сарысуда табылған антиденелер вирустарды нейтралдайды.

Экспресс-диагностика. Бұл әдіс клиникалық материалды алғаннан кейін бірнеше сағат арасында жауап алуға мүмкіндік береді. Аурулардан алынған материалдан вирусты анықтауға болады. Экспресс әдістің негізі - клиникалық материалды зерттеу. Науқастан алынған материалдағы (қан, шырышты қабықтың жағындысы, үлкен және кіші дәрет) вирустарды сезімтал биологиялық жүйелер арқылы (торша өсіндісі, тайық эмбрионы, лабораториялық жануарлар) өсіріп көбейтудің қажеті жоқ.

1. Электронды-микроскопиялық зерттеу (ЭМ). Бұл әдісті әдетті тәсілдермен өсіруге келмейтін (коронавирустар, ротавирустар, А және В гепатит вирустары) немесе типтік морфологиядағы (шешек вирусы) вирустарды анықтаған кезде ерекше бағалы. ЭМ пайдалануы мынадай жағдайлармен шектеледі, егер клиникалық материалда вирус бөлшектерінің концентрациясы 10⁴-10⁵ мл кем болмау керек. Ұқсас вирустарды ажыратып анықтауға электронды-микроскопиялық әдіс қолданылмайды.

2. Иммунды электронды-микроскопиялық әдіс (ИЭМ). Вирус бөлшектерімен антиденелердің байланысқанында иммунды комплекстер пайда болады. Оларды центрифуга арқылы тұнбаға түсіреді. Электронды-микроскоппен зерттегенде вирустардың жиынтығы көрінеді, ал антиденелер айқын көрініп тұрмаған соң байқалмайды. Белгілі түрге спецификалық антиденелер арқылы иммунды комплекстегі вирустарды анықтауға болады.

3. Жарықты микроскоппен зерттеу. Бұл әдіс басқалар мен салыстырғанда сирек қолданады. Ірі шешек вирусын Морозов әдісімен боялған микропрепаратта көруге болады. Бұл әдіспен Романовскии-Гимзе және басқа әдістермен боялған гиспопрепаратты клетка ішіндегі қосындылар анықталады. Мысалы: зақымдалған нейрондарда Бабеш-Негри денешіктерін осы әдістермен бояғанда байқалады.

4. Иммунофлюоресценция реакциясы – РИФ көптеген вирус инфекцияларының экспресс-диагностикасының бірден бір әдісі. Себебі, люминесцентті микроскоптың кең қолдануы, реакция техникасының қиын еместігі, әдістің жоғары сезімталдығы. РИФ немесе Кунс реакциясының негізін флюоресцентиоционат (ФИТЦ) немесе басқа флюорохромдардың антиденелерімен химиялық комплекс байланысуы, ФИТЦ-пен химиялық байланысқан антиденелер (иммунды сарысулардың құрамында) иммунологиялық ерекшелігін сақтайды және белгілі антигендермен өзара байланысқа түседі. Антигендер мен антиденелердің комплекстерін микропрепаратты сары-жасыл жарық арқылы люминесценттік микроскоппен өте оңай анықтауға болады.

А) иммунофлюоресценцияның түзу реакциясы – зерттелген антигендерге қарсы иммунофлюоресценттік сарысулар пайдаланылады

Б) РИФ түзу емес реакциясы – екі түрлі сарысулар пайдалануға негізделген. Басында зерттелетін антигенге қарсы флюоресценттік емес антиденелер қолданады, ал реакцияның екінші кезеңінде пайда болған антиген – антиденелер комплексін ФИТЦ-пен байланысқан антисары су қосылады. Бұл ФИТЦ-пен байланысқан сарысу (түрге қарсы сарысу) құрамында реакцияның бірінші кезеңінде қолданған флюоресценттік емес антиденелерге немесе гамма-глобулиндерге қарсы анти-антиденелер болады.

Егер, РИФ бірінші кезеңінде қолданған антисары су қойлардан иммунизация арқылы алынса, екінші кезеңінде қолданатын түрге қарсы сарысу дайындау үшін қойдың гаммаглобулиндерімен басқа түрді ажыратады (үй қояны, есек және т.б.) иммунизациялайды. Түрге қарсы сарысу құрамындағы антиденелер ФИТЦ-пен химиялық байланысқан. Сонымен зерттелген антигендерді екінші қабатпен антиглобулиндер жабады (бірінші қабат - флюоресценттік емес антиденелер, олар антиглобулиндері бар сарысуға антиген ретінде болады). Реакция нәтижесінде люминесценттік микроскопта антиген-антидене-анти-антиденелер комплекстері көрінеді. Егер иммунофлюоресценцияның түзу реакциясында әрбір вирус антигендеріне қарсы дереу антисарысуларды ФИТЦ-пен химиялық байланыстыру керек болса, ал түзу емес реакциясында флюорохром тек түрге қарсы сарысумен байланысқан.

А) реакцияның түзу варианты. Мысалға, респираторлы вирус инфекциясында вируспен зақымдалған торшаларды назофарингиальді секреттен алуға болады. Назофарингиальді секреттегі торшаларды сұйықтан бөліп алып фосфатты буферлі ерітіндімен шаяды. Торша тұнбасына фосфатты буферлі ерітіндісінің бірнеше тамшысы қосылады содан 3-4 жұғын-препаратты дайындайды. Жұғындыларды ауада кептіреді әрі ацетонмен бекітеді. ФИТЦ-пен бекітілген құрамында вирусқа қарсы антиденелер бар сарысудың жұмысты ерітіндісімен препаратты бояйды. Термостатта 30мин. экспозициядан кейін препаратты 3 рет фуцермен, содан соң бір рет дистилденген сумен шаяды. Препарат люминесцентті микроскоппен зерттеледі. Оң реакцияда препарат сары-жасылмен жарқырайды, теріс реакцияда жарқырамайды.

Б) түзу емес реакция варианты. Дайындалған жұңынға құрамында вирустарға қарсы антиденелері бар сарысу тамызады, 30 мин соң экспозиция, ФБР-мен және дистилденген сумен шаяды, оның үстіне ФИТЦ-пен байланысқан антисарысу тамызады.

1. Иммуноферментті анализ – ИФА, антигендер мен спецификалық антиденелердің қатынасына негізделген. Реакцияда ферменттермен белгіленген вирустарға қарсы немесе түрге қарсы антиденелер пайдаланылады. Антигендер және ферменттер байланысқан антиденелер комплекстері спецификалық субстрат (хромоген) арқылы анықталады. Түссіз хромоген ферментпен байланысып бояулы жағдайда өтеді.

Антигендер+ антиденелер (фермент)+ хромоген= бояу.

Антигендер+ антиденелер комплекстерінің саны материалдың боялуының дәрежесіне тура пропорциональді.

Реакцияның бірінші компоненті – антиген, қатты фазаға тұнады. Полистирольды пластинкалардың тегіс түбін қатты фаза деп атайды. Арнайы буфер ерітінділерді инкубациялағанда антиген электростатикалық күш әсерімен қатты фазаға адсорбцияланады.

Пероксидаза, сілтілі фосфатаза, цитохром С және басқа ферменттер антиденелерді белгілеу үшін пайдаланылады. Ферменттер байланыстын субстрат ретінде хромогендер – ортофенилендиамин, ортотолуидин, бензидин және басқа түрлері қолданылады.

ИФА әдістерінің ішінде түзу және түзу емес РИФреакцияларына ұқсас варианттар жиі пайдаланылады.

ИФА-ның тура вариантында белгісіз зерттелетін антигендерге қарсы ферментпен байланысқан антиденелер қолданылады:

зерттелетін антигендер+ антиденелер(фермент)+ хромоген.

ИФА-ның түзу емес вариантында, керісінше, белгілі антигендер, белгілі ферментпен байланысқан түрге қарсы сарысу және зерттелетін сарысу (бұдан вирус нейтралдау антиденелер анықталады);

Белгілі анти- науқастың зерттелетін ферментпен белгіленген гендер + сарысуы + иммуноглобулиндеріне + хромоген қарсы антиденелер (түрге қарсы антиденелер)

ЖИТС диагностикасында қолданылатын ИФА-ның техникасы (түзу емес вариант);

Реакция компоненттері:

1. аурудың зерттелетін сарысу
2. полистиролдық микропланшеттер, олардың шұңқырларында алдын-ала вирусты антигендер адсорбцияланған.
3. пероксидазамен белгіленген антиглобулиндық (түрге қарсы) сарысу құрамында АИВ-ге қарсы антиденелер бар және құрамында АИВ-ке қарсы антиденелері жоқ сарысулар.
4. ортофенилдиамин
5. фосфатты буферлі ерітінділер, твин-20 – шұңқырды шаю үшін керек.

Реакция өткізу техникасы:

1. Полистиролдық микропланшеттің шұңқырларына аурудың зерттелетін сарысуы құйылады. Экспозиция 1-2 сағат 37⁰С.
2. Иммунологиялық реакцияда байланыспаған зерттелетін сарысудағы антиденелерден шұңқырларды шайып алу.
3. Пероксидазамен байланысқан адамның гаммаглобулиндеріне қарсы, түрге қарсы сарысу құрамындағы антиденелерді енгізу.

Экспозиция 2 сағат 37⁰С.

1. Байланыспаған конъюгатты шаю.
2. Ортофенилдің ерітіндісін енгізу, инкубация 30 мин. қараңғыда, 18-20⁰С. Инкубация процесі кезінде пероксидазаның химиялық әсерінен ортофенилдиамин қоңыр түске боялады.

Нәтижесі оң сарысу қосылған ерітінді осы сияқты болады.

Нәтижесі теріс сарысу қосылған ерітінді боялмайды.

6. РИА – радиоиммунды анализ. Антиденелерді, антигендерді радиоактивтік изотоптармен таңбалайды (йод^{131, 135}, сутегі – Н³, көміртегі – С¹⁴). Радиоактивті таңбалы антигендер-антиденелер комплекстері арнайы радиоактивті есептегіш арқылы анықталады. Клиникалық сынақта зерттелетін антигендердің немесе антиденелердің мөлшері радиоактивтікке тура пропорцианальді. Радиоиммунды анализді РИФ-пен салыстырғанда жоғары, ал ИФА реакциясымен тең түседі. Ал бұл реакцияның (РИА) кемшілігі белгіленген компоненттердің тұрақсыздығы, биологиялық қауіптілігіне және радиоактивті есептегіш қолдану керектігіне байланысты.

Иллюстративті материал