Тема 6.1. МОДИФИКАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ, МУТАЦИИ, РЕКОМБИНАЦИЯ И ПЕРЕНОС ГЕНОВ МЕЖДУ БАКТЕРИЯМИ

План

А Программа

1. Способы сохранения генетической информации у микробов.

2. Модификационная изменчивость.

3. Мутационная изменчивость.

4. Рекомбинация ДНК.

5. Способы передачи генетической информации между бактериями — трансформация, трансдукция, конъ­югация.

6. Фаговая конверсия.

7. Сохранение и изменение генетической информации в микробных популяциях.

А Демонстрация

1. S-и R-формы колоний у E.coli.

2. Таблицы со схемами передачи генетической информа­ции между бактериями в опытах трансформации, трансдукции и конъюгации.

А Задание студентам

1.Определить частоту образования рекомбинантов Leu⁺ в опыте конъюгации.

2. Определить частоту образования трансдуктантов (ре­комбинантов) в опыте трансдукции фагом X dgal.

3. Определить частоту образования трансформантов (ре­комбинантов) в опыте трансформации признака Str^r (стрептомицинрезистентности) у Bacillus subtilis.

А Методические указания

Постановка опыта трансформации(рис. 6.1; на вклейке). Реципиент — штамм Bacillus subtilis Str⁵ (сенная палочка, чув­ствительная к стрептомицину); донор — ДНК, выделенная из

штамма B.subtilis Str^r (устойчивого к стрептомицину). Селек­тивная среда для отбора рекомбинантов (трансформантов) — питательный агар, содержащий 100 ЕД/мл стрептомицина. К 1 мл бульонной культуры B.subtilis добавляют 1 мкг/мл ДНК донора. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Затем в пробирку вносят смесь 0,1 мкг/мл раствора ДНКазы в 0,5 мл раствора хлорида магния для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма, и выдержива­ют в течение 5 мин. Для определения количества образовав­шихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов (трансфор­мантов) 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры в изотоническом растворе хлорида на­трия готовят 10-кратные разведения до Ю^-5—10^_б (для полу­чения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля — на агар со стрептомицином. На последней среде реципиентная культура не должна расти, поскольку она чувствительна к стрептомицину. Посев инкубируют при 37 °С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту транс­формации по отношению количества выросших рекомбинант-ных клеток к числу клеток реципиентного штамма.

Допустим, что при высеве 0,1 мл культуры реципиентного штамма в разведении Ю^-5 выросло 170 колоний, а при высеве 0,1 мл нераз­веденной смеси — 68 колоний рекомбинантного штамма. Поскольку каждая колония образовалась в результате размножений только одной бактериальной клеткой, то в 0,1 мл засеянной культуры реципиента содержится 170x10^ жизнеспособных клеток, а в 1 мл — 170х10⁶, или 1,7х10⁸. В то же время в 0,1 мл смеси находится 68 рекомбинант-ных клеток, а в 1 мл — 680, или 6,8х10². Таким образом, частота трансформации в данном опыте будет равна:

Постановка опыта специфической трансдукции(рис. 6.2; на вклейке). Реципиент — штамм E.coli lac, лишенный Р-галакто-зидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг — фаг X dgal, в геноме которого часть генов замещена р-галактозидазным опероном E.coli. Он явля­ется дефектным, т.е. не способен вызывать продуктивную ин­фекцию, заканчивающуюся лизисом кишечной палочки, и обозначается буквой d (фаг dgal) с названием содержащегося в его геноме бактериального оперона gal. Селективная среда — среда Эндо, на которой лактозоотрицательные бактерии реци­пиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозо-положительные колонии рекомбинантного штамма приобрета­ют красный цвет с металлическим оттенком. К 1 мл 3-часовой

бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага dgal в концентрации 10⁶—10⁷ частиц в 1 мл. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 60 мин, после чего готовят ряд 10-кратных разведений (в зависимости от предполагаемой концентрации бактерий) для получения сосчи­тываемого количества колоний. Из пробирки с разведением Ю^-6 делают высев по 0,1 мл культуры на 3 чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют в течение 1 сут, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют частоту трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу кле­ток реципиентного штамма.

Например, после посева 0,1 мл смешанной культуры в раз­ведении 10"⁶ на 3 чашках со средой Эндо выросло соответст­венно 138, 170 и 160 бесцветных колоний реципиентного штамма, на первой и последней чашках — 5 и 1 колонии транс­дуктантов красного цвета. Следовательно, частота трансдукции в этом случае будет равна:

Постановка опыта конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, который содержит ген leu, контролирующий синтез лейцина(рис. 6.3; на вклейке). Донор — штамм E.coli K12 Hfr leu⁺ Str⁵; реципиент — штамм E.coli K12F^- leu⁺ Str^R. ,Hfr — обозначение состояния, для которого характерна высокая час­тота рекомбинации. Селективная среда для выделения реком­бинантов — минимальная глюкозосолевая среда: КН2РО4 — 6,5 г, MgS0₄ - 0,1 г, (NH₄)₂S0₄ - 1 г, Ca(N0₃)₂ - 0,001 г, FeS0₄ -0,0005 г, глюкозы — 2 г, стрептомицина — 200 ЕД/мл, дистил­лированной воды — 1 л.

К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 37 °С в течение 30 мин. Затем смесь разводят до 10^-2— Ю^-3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают донорный и реципиентный штаммы, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейци­ну. Кроме того, культуру донорного штамма высевают на селек­тивную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма — на полную среду (питательный агар) с антибиотиками для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкуби­руют при 37 °С до следующего дня. После подсчета числа вырос­ших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.

Например, после посева 0,1 мл смеси донорных и реципиентных культур в разведении 10 ² выросло 150 колоний рекомбинантов, а после посева 0,1 мл культуры реципиента из разведения 10~° — 75 колоний. Таким образом, частота рекомбинации будет равна:

150 х 10 х 100 ₌ 1,5 х 10⁵ _4

75 х 10 х 10⁶ 7,5 х 10⁸ '