Стадии метанового брожения: гидролиз, кислотогенная, ацетогенная и метаногенная.

Остановимся более подробно на различных стадиях ме­танового брожения. Здесь следует заметить, что в стабильно работающих анаэробных реакторах отдельные стадии брожения в значительной степени, синхронизированы и в кине­тике процесса практически не проявляются. Тем не менее, знание их закономерностей дает возможность как интенси­фицировать процесс анаэробной очистки, так и предотвра­щать его сбои.

Стадия гидролиза

Гидролиз, входящих в ОВ стоков макромолекул (полисаха­ридов, белков, липидов), осуществляется экзогенными фер­ментами, экскретируемыми в межклеточную среду различ­ными гидролитическими микроорганизмами. Действие этих ферментов приводит к продуцированию относительно прос­тых продуктов, которые эффективно утилизируются самими гидролитиками и другими группами бактерий на последую­щих стадиях метаногенеза (см. рис. 1).

Большую роль в метаногенном сообществе играют микро­организмы, гидролизующие полисахариды, присутствующие в стоках различных отраслей пищевой и целлюлозно-бумаж­ной промышленности. Выделенные из анаэробных реакторов, сбраживающих стоки с взвешенными веществами, содер­жащими целлюлозу, штаммы целлюлолитических бак­терий, как правило, являются строгими анаэробами и их концентрация при значительном содержании целлюлозных компонентов в стоке обычно составляет 10⁵—10⁶ клеток/мл ила, достигая 10¹¹ кл/мл для животноводческих стоков. В настоящее время описано более 20 видов анаэробных целлюлолитических бактерий, принадлежащих к родам Clostridium, Bacteroides, Butyrivibrio, Ruminococcus, Eubacterium, Acetivibrio, Micromonospora. В анаэробных реакторах целлюлозообразующие бактерии представлены в основном клостридиальными формами. В частности, ведущей формой в термофильных условиях является Clostridium thermocellum. Выделены и описаны анаэробные гидролитические бак­терии, разлагающие гемицеллюлозу, пентозаны, полисахари­ды клеточных стенок бактерий, крахмал, пектин. Они при­надлежат к различным родам: Clostridium, Bacteroides, Lactobacillus, Bacillus и др. Численность бактерий, гидролизующих полисахариды в анаэробных реакторах, зависит от состава и концентрации сбраживаемого стока и конструкции реактора, так численность амилолитиков особенно высока на отходах крахмального производства. Биохимия брожения полисаха­ридов изучена достаточно хорошо на чистых культурах. Ос­новными продуктами являются различные жирные и карбоновые кислоты, спирты, водород и углекислота. Показано, что в метаногенном сообществе метаболизм гидролитиков, в част­ности, целлюлозоразрушающих бактерий, подвержен регуляции со стороны метановых и гомоацетатных бактерий, потреб­ляющих водород.

Большинство протеолитических бактерий, выделяемых из анаэробных реакторов, также являются клостридиями, спо­собными расти за счет сбраживания пептидов и аминокислот, образующихся при гидролизе белковых соединений. В этом состоит их отличие от протеолитической микрофлоры руб­ца, характерной особенностью которой является потребность в углеводах и неспособность использовать аминокисло­ты. Протеолитической активностью обладают также обнару­живаемые в метантенках бактерии родов Peptococcus, Bifidobacterium, Staphylococcus, Eubacterium. Из реактора, сбраживающего стоки кожевенного завода, выделена нес­поровая термофильная протеолитическая бактерия Thermobacteroides proteoliticus. Термофильные протеолитические бактерии, развивающиеся при температуре до 80—85°, обнаружены в термофильно сброженном навозном стоке. В осадке навозохранилища и иле гиперевтрофицированного водоема обнаружено присутствие психрофильных протеолитиков, развивающихся на белковых субстратах при тем­пературе вплоть до 0°. У некоторых протеолитических клостриий высокая протеолитическая активность связана с вирулентностью. Большинство протеолитических бактерий способны также сбраживать углеводы, что прдтверждает высо­кую пластичность микроорганизмов, входящих в метановый биоценоз.

Процесс анаэробного гид­ролиза липидов осуществляется специальными фермен­тами—липазами. Большинство липаз микробиологического происхождения атакует липиды, представляющие собой глицеридные эфиры жирных кислот с длинной цепью (ЖКДЦ) по 1 и 3 позиции глицерина. .И только отдельные липазы обла­дают способностью осуществлять полный гидролиз липидов с образованием глицерина и ЖКДЦ. В ана­эробных реакторах липолитическая микрофлора представ­лена клостридиями и микрококками. К гидрогенизации нерастворимых жирных кислот способны отдельные штам­мы бактерий родов Ruminicoccus, Eubacterium, Butyrivibrio .

Анаэробный гидролиз лигнина практически не происходит, однако показано, что его фрагменты с молекулярным весом до 330 разлагаются в накопительных культурах с образова­нием СО₂, СН₄ и ацетата. Мономерные ароматические производные лигнина неустойчивы в анаэробных условиях и разлагаются с образованием жирных кислот. Имеются данные о биодеградации одного из мономерных компонен­тов лигнина — кониферилового спирта в анаэробных условиях по одному из побочных метаболических путей. Фаза гидролиза при метановом брожении тесно связана с фазой ферментации (кислотогенной), причем гидролити­ческие бактерии осуществляют обе фазы, и их иногда объеди­няют с ферментативными бактериями.

Кислотогенная стадия

Группа ферментативных бактерий (бактерии-бродильщики, микрофлора рассеяния) представляют собой сложную смесь многих видов бактерий, большая часть которых являет­ся строгими анаэробами. Наличие таких бактерий не ис­ключает одновременного присутствия значительного коли­чества факультативных анаэробных бактерий, типа стрепто­кокков и кишечных бактерий. Доминирующими организмами могут быть анаэробные мезофильные бактерии типа Bacteroides, Clostridium, Butyrivibrio, Eubacterium, Bifidobacterium, Lactobacillus и многие другие. Среднее время генерации для бактерий этой группы составляет несколько часов, числен­ность их в анаэробных реакторах высока и достигает 10⁹—10¹¹ кл/мл. Выделяемые в виде чистых культур термофиль­ные микроорганизмы, как правило, представляют собой бактерии, относящиеся к роду Clostridium. Основной особенностью, бродилыциков является способность ис­пользовать те же субстраты, что и гидролитики, то есть продукты гидролиза, полимерных соединений и поступающие со стоком мономеры, но в более низких концентрациях. Скрининг микроорганизмов метаногенного биоценоза пока­зал наличие 293 видов анаэробных микроорганизмов, из ко­торых только 23 вида продуцировали метан. Видно, что в биоценозе наблюдается значительное превосходство раз­ раз­нообразия ферментативных бактерий над метанообразующими.

В общем же этап, определяемый деятельностью фермен­тативных бактерий, рассматриваемый применительно к пери­одическому, процессу, сопровождается резким уменьшением, прежде всего, содержания углеводов в среде, снижением ве­личины рН среды, возрастанием общего содержания ЛЖК, представленных муравьиной, уксусной, пропионовой, масля­ной и другими кислотами. Качественный и количественный сос­тав продуктов брожения на этой стадии. может сильно ме­няться в зависимости от вида стока, температуры, рН, Eh и других условий. Ферментация углеводов кислотогенкой микрофлорой во. многом напоминает ферментацию сложных органических соединений в рубце животных и происходит по пути Эмбдена — Мейергофа— Парнаса. Характер образующих продуктов зависит от того, насколько глубоко прошел катаболизм пирувата и от парциального давления водорода в системе. Так, например, при резком увеличении подачи субстрата, в реакторе могут образовываться избы­точные количества ЛЖК и водорода, снижая значе­ния рН и Eh. Причем увеличение концентрации водорода в газовой фазе, которая при стабильном процессе метаново­го брожения не превышает 100 частей на млн. является указанием на дестабилизацию процесса. При увеличе­нии концентрации водорода кислотогенные бактерии через систему обратных связей задействуют альтернативные мета­болические пути (синтез этанола, пропионата, бутирата и дру­гих высших ЛЖК). Такая регуляция является, как уже от­мечалось выше, характернейшей чертой метанового биоце­ноза, о ее молекулярных механизмах будет сказано ниже. Накопление ЛЖК и спиртов крайне нежелательно, так как их разложение может также являться лимитирующей сту­пенью процесса.

В целом, из-за широкого видового разнообразия кислото­генные бактерии достаточно устойчивы к изменениям ус­ловий среды реактора. Кроме природных субстратов фер­ментативные бактерии метаболизируют также фенольные, азот- и серосодержащие соединения, находящиеся в стоках
сульфатной и сульфитной варки целлюлозы, химической пе­реработки нефти, газификации угля и др. Субстраты, содер­жащие серу и азот, могут вызывать рост сульфатредуцирующих бактерий и денитрификаторов.

Кислотогенная стадия метанового брожения в кинетичес­ком плане изучалась в работах, где конверсии подвергались полисахариды(целлюлоза, ксилан, галактоманнан, глюкоманнан), моносахариды (глюкоза, ксилоза, галак­тоза, манноза, арабиноза), белки (альбумин), аминокислоты (лизин, аланин, глутаминовая кислота и т. д.). Показано, что основными Продуктами этой стадии метаногенеза являются водород, углекислота, этанол, ацетат, пропионат, бутират. На основе данных количественного анализа образуемых про­дуктов (в условиях их предельного накопления) авторы предложили универсальное химическое уравнение для кислотогенной стадии метаногенеза углеводов, включая по­лисахариды со степенью полимеризации до 150, где стадия гидролиза не является лимитирующей:

Для термофильного режима подобной стабильности коэф­фициентов не наблюдается, что вероятно связано с мень­шим разнообразием видового состава микроорганизмов в этом режиме.

В результате исследования обменного взаимодействия между ферментативными бактериями и бактериями, потреб­ляющими водород, было показано, что концентрация водо­рода в экосистеме играет важную роль в регулировании состава продуктов, образующихся под действием фермен­тативных бактерий. Ферментативные бактерии могут быть разделены на две группы в соответствии с их способ­ностью образовывать молекулярный водород. Бактерии, ко­торые не способны образовывать молекулярный водород в качестве продукта брожения, имеют стабильный метабо­лизм и фиксированный массовый баланс. Типичными приме­рами являются пропионовые и молочнокислые бактерии. Meтаболизм бактерий, - образующих водород, зависит от парциального давления.

Соответствующие стехиометрические коэффициенты для мезофильного режима слабо зависят от природы углевода и равны:

Центральным исходным метаболитом в клетке бактерии бродилыцика является пируват, который образуется как из углеводов, так и из аминокислот после их дезаминирования. При низком парциальном давлении водорода в системе тр. есть когда он эффективно удаляется, образуются окис ленные, продукты: углекислота и ацетат — непосредственны предшественники метана. При избытке восстановителя об­разуются менее окисленные продукты — этанол, бутират пропионат, лактат.

Образование водорода происходит в соответствии с реакцией: .

Равновесие этой реакции смещено влево, поэтому образова­ние водорода происходит только при его низком парциальном давлении, что обеспечивается деятельностью водород-использующих метаногенов. Если такая ситуация реализуете) при конверсии углеводов, то пируват расщепляется до ацетата, СО₂ и Н+ В целом же по мере увеличения парциального давления водорода, как уже отмечалось выше, поток электронов с NADH смещается в сторону образования молекулярного водорода, а более восстановленных, чем ацетат, метаболитов. Многочисленные примеры регуляции метаболизма первичных анаэробов водородом приведены в обзорах.

Помимо углеводов, ОВ сточных вод обычно содержат значительное количество белков и жиров. Белки при метаногенезе гидролизуются в пептиды и аминокислоты, которые затем ферментируются в уксусную, пропионовую, масляную, изомасляную, изовалериановую, валериановую кислоты, фенилуксусную, фенилпропионовую, бензойную и индолилуксусную, а также в аммиак и сероводород. Последние два соединения именно по этой причине в примесных количест­вах присутствуют в составе биогаза. В целом же основные закономерности кислотогенеза белков и аминокислот в общем аналогичны закономерности конверсии углеводов.

Глицериды, фосфолипиды и другие жиры гидролизуются с высвобождением ЖКДЦ, а также глицерина и галактозы, ферментация которых проходит по упомянутому выше пути Эмбдена—Мейергофа—Парнаса. В процессе ферментации ЖКДЦ медленно подвергаются дальнейшему расщеплению о чем подробно будет сказано ниже.

Ацетогенная стадия

Разложение восстановленных органически соединений, про­дуктов кислотогенной стадии, осуществляют облигатные протонвосстанавливающие или облигатносинтрофные бактерии, как правило нуждающиеся в водородиспользующих партне­рах, за что их часто называют синтрофными бактериями. Взятые в целом как группа, они в процессе метаногенеза расщепляют спирты и жирные кислоты (линейные, изо- и ароматические) с образованием уксусной кислоты, водорода и углекислоты. Удаление водорода, кроме метановых бак­терий, могут осуществлять сульфатредукторы, что более вы­годно термодинамически.

Первый вид ацетогенных бактерий выделен Брайантом из считавшегося чистым видом симбионта Methanobacillus omelianskii. Выделенный организм осуществляет окисле­ния этанола до ацетата и водорода:

Термодинамически эта реакция становится выгодной только при эффективном удалении водорода, которое и осуществляют водородиспользующие метаногены.

В настоящее время описано несколько облигатных протонвосстанавливающих бактерий, использующих жирные кис­лоты. В 1979 г. в лаборатории Брайанта была выделена и за­тем описана бактерия Syjitrophomonas volfei, которая ана­эробно окисляет бутират в кокультуре с Desulfovibrio sp. или Methanospirillum hungatii. Годом позже выделили синтрофную ассоциацию, содержащую бактерию Syntrophobacter wolinii, окисляющую пропионат в кокультуре с теми же партнерами. Затем была описана бактерия Syntrophomonas buswelii, разлагающая бензоат в бинарной культуре с метаногеном до метана, ацетата и СО₂.

Соответствуют щие реакции для этих бактерий приведены в таблице

Кроме S. volfei бутират окисляют Syntrophomonas sapovoran и Clostridium bryantii. Эти организмы способны использовать также кротонат и другие растворимые и нерастворимые ЖКДЦ, при этом первые две из них не нуждаются в водород- использующем партнере и сбрасывают электроны на про­межуточные продукты, образуя пропионат. Конверсия изомерных жирных кис­лот, например изомасляной, протекает через предваритель­ную изомеризацию последней в бутират.

Из данных таблицы видно, что термодинамическая воз­можность протекания реакций разложения восстановленных продуктов определяется жесткими условиями в отношении парциального давления Н₂. Расщепление пропионовой кисло­ты может происходить при парциальном давлении водорода ниже 9*10⁵ атм. Аналогичные критические точки для конверсии бутирата и этанола равны 2*10³ и 0,15 атм соответственно. Реакции анаэробного разложения жирных кислот называют также реакциями β-окисления.

При небольшом увеличении парциального давления водорода выше критических значений, деятель­ность соответствующих ацетогенных микроорганизмов пре­кращается, особенно это относится к бактериям, расщеп­ляющим пропионат, который играет крайне важную роль в анаэробном разложении сложных органических субстратов, так как 30% электронного потока при их разложении «про­текает» через пропионат (рис.1). Поэтому при возник­новении нарушений режима работы анаэробных реакторов, например при перегрузках, начинает резко накапливаться пропионовая кислота (в первую очередь) и другие высшие ЛЖК. Таким образом, существует корреляция между накоп­лением этих кислот и парциальным давлением водорода. Так как современные приборы позволяют относительно про­сто и точно следить за последним параметром, то он может служить ранним индикатором перегрузки реактора и нару­шения сбалансированности процесса.

Парциальное давление водорода в метаногенной экосистеме регулирует не только конечные продукты жизне­деятельности ферментативных бактерий, но и их последую­щее расщепление с помощью ацетогенных бактерий. Как правило, концентрация водорода в жидкой среде анаэроб­ных реакторов варьирует в диапазоне 10^-8—10^-5 M. Связь между парциальным давлением и молярной кон­центрацией водорода определяется законом Генри и для мезофильного режима (35° С) имеет вид:

Из вышеизложенного, на ацетогенной стадии существует тесная синтрофная связь между водородогенными бактериями и водородотрофами. Большинство водородогенных реакций являются энергетически невыгодными при стандартных термодинамических условиях и могут осущест­вляться только тогда, когда P_H2 в системе поддерживается на низком уровне с помощью водородотрофов. При биодеградации сложных органических смесей может реализо­ваться ситуация, когда высокоэнергетические водородогенные субстраты, окисляясь, создают достаточно высокий уровень Рн₂ который будет блокировать расщепление низ­коэнергетических субстратов.

В метановом биоценозе существует тес­ный симбиоз между ацетогенными батериями и водородиспользующими метаногенами, определяющую роль в нем играет межвидовой перенос водорода. Воздействие массопереноса может менять локальную концентрацию водорода и влиять на кинетику процесса.

Метаногенная стадия

Сложный процесс распада ОВ в анаэробных условиях за­вершают метанобразующие бактерии или метаногены. Они являются облигатными анаэробами, чувствительными к кис­лороду. Окислительно-восстановительный потенциал среды их роста составляет — 330 мВ и ниже. Среди метанобразующих организмов встречаются психрофильные, мезофильные и термофильные виды. Описаны также галофильные метановые бактерии, обитающие в осадках соленых водое­мов. Для обеспечения жизнедеятельности чистых культур метаногенов в первую очередь необходим строжайший ана­эробиоз и нейтральная или слабощелочная реакция среды.

Метанобактерии могут использовать в качестве источни­ков энергии и углерода ограниченное количество субстра­тов— всего 8: СО₂+Н₂, формиат, закись углерода, метанол, ацетат, моно-, ди- и триметиламины (табл. 2).

Среди них наиболее важным является ацетат, из которого при разложе­нии сложных ОВ образуется более 70% метана (рис. 1). Помимо указанных выше восьми источников углерода ника­кие другие его соединения не поддерживают рост метанобразующих бактерий, правда имеется сообщение об об­разование метана из метильных групп многоуглеродных спиртов.

Метаногенные бактерии 90—95% используемого углерода превращают в метан, чтобы за счет сопряженного образова­ния трансмембранного потенциала аккумулировать необхо­димую для конструктивного обмена энергию, и лишь 5—10% углерода превращается в биомассу. Благодаря указанной особенности до 80—90% ОВ, разлагающегося в процессе развития метаногенного консорциума, превращаются в газ.

По типу использования субстратов все виды метанобразующих организмов могут быть условно разделены на 3 подгруппы (рис. 2). Следует отметить, что здесь мы не рассматриваем группу галофильных метаногенов. Бак­терии первой подгруппы используют Н₂+СО₂, к ним отно­сится большинство метановых бактерий, некоторые из них способны также использовать формиат.

Вторая подгруппа представлена ацетатиспользующими метаногенами. Осуществлять реакцию способны пред­ставители только двух родов Methanosarcina и Methanothrix, причем для последних ацетат является единственным субстратом роста, к которому они обладают очень высоким сродством. В настоящее время описано три вида метанотриксов: два мезофильных М. soehngenii и М. concilii и один термофильный М.thermoacetophila.
Так как при реакции выигрыш свободной энергии Гиббса
относительно невелик, то скорость роста бактерий второй
подгруппы достаточно низка — время генерации исчисляется
сутками. Метанотриксы являются определяющей группой
бактерий при очистке сточных вод, они способны использовать ацетат в очень низких концентрациях (до7мкМ) и обеспечивают глубокую очистку стока. |

К третьей подгруппе могут быть отнесены метаносарцины, способные утилизировать все известные к настоящему времени метаногенные субстраты, за исключением формиата. Наиболее предпочтительным субстратом для них является метанол, наименее — ацетат, сродство к которому у них на порядок ниже, чем у метанотриксов. К настоящему времени описано несколько видов метаносарцин, в том, числе термофильная М. thermophila, не использующая водо­род.

Приведенные в таблице 2 реакции на биохимическом
уровне реализуются с помощью исключительно специфичных только для метаногенов метаболических путей при
участии уникальных метаногенных кофакторов, таких как
метаноптерин, фактор F₄₂₀, фактор F₄₃₀, кофермент М и др.
На наличии этих соединений и основан достаточно простой
метод определения водородиспользующих метаногенов в
смешанных культурах с помощью флуоресцентной мик­роскопии: они дают либо зеленую флуоресценцию за счет
фактора F₄₂₀ или голубую флуоресценцию за счет 7-метилптерина.

Метанобразующие бактерии представлены видами с раз­
ной морфологией. Среди них имеются округлые, ланцето­
видные, палочковидные, спиральные, нитевидные и другие
формы. Все метанобразующие бактерии имеют клеточные
стенки. Но в отличие от большинства других бактерий в нее
не входит муреиновая кислота и аминокислоты в D-форме.
У части видов, например, Methanococcus vannieli стенка образована белковыми субъединицами, у других, в том числе
Methanobacterium thermoautotrophicum, содержит особый
пептидглюкан, называемый еще псевдомуреином. В зависимости от состава клеточной стенки метанобразующие бактерии могут окрашиваться как грамположительные или
граммотрицательные бактерии. Особое строение клеточных
стенок обуславливает устойчивость метановых бактерий кантибиотикам, которая варьирует у разных видов. Другое
отличие метанобразующих бактерий от остальных бактерий
проявляется в том, что их клеточные мембраны содержат
глицериновые эфиры полиизопреноидов.