Учебно-исследовательская работа студентов на занятии

1. Проделать лабораторную работу "Определение остаточного азота и билирубина в сыворотке крови".

2. Сделать выводы по результатам проведенных опытов. Оформить результаты опытов.

3. Подготовиться к защите лабораторной работы и решению задач (ориентировочные задачи и вопросы приведены ниже).

Лабораторная работа

I. Определение остаточного азота в сыворотке крови.

Оборудование: 1. Штатив с пробирками.
  2. Пипетки на 0,1мл,1 мл и 5 мл.
  3. Колба на 50 или 100 мл.
  4. Центрифуга.
  5. Центрифужные пробирки.    
     
Реактивы: 1. Реактив А.
  2. Реактив В.
  3. КI кристаллический.
  4. НСl
  5. 1% раствор крахмала
  6. Сыворотка.
  7. Дистиллированная вода.
  8. 0,005 Н раствор тиосульфата натрия.
         

Принцип метода. Остаточный азот – это небелковый азот биологических жидкостей. Гипобромитный метод его определения основан на свойстве гипобромита разрушаться при взаимодействие с азотистыми веществами безбелкового центрифугата. Остаток непрореагировавшего гипобромита определяют йодометрически – титрованием тиосульфатом натрия. Для расчета количества остаточного азота определяют количество разрушенного гипобромита, как разность между титром контрольной пробы (не содержащей остаточного азота) и опытной пробы (с остаточным азотом).

Ход работы. Для осаждения белков в пробирку наливают 1 мл дистиллированной воды, 0,1 мл сыворотки и 4,0 мл осаждающего реактива. Через 10 мин смесь центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. За это время готовят рабочий раствор гипобромита, смешивая 9 частей реактива А и 1 часть реактива В. В колбу для титрования отбирают 4 мл центрифугата, добавляют 5 мл рабочего раствора гипобромита, перемешивают и оставляют на 1-2 мин. Затем добавляют несколько кристалликов КI, 3 мл раствора НСl, смесь взбалтывают и титруют 0,005Н раствором тиосульфата до слабо-желтого цвета. Добавляют 2-3 капли раствора крахмала и дотитровывают до обесцвечивания. Одновременно с опытной готовят контрольную пробу, содержащую 4 мл осаждающего реактива, 5 мл рабочего раствора гипобромита, несколько кристалликов KI и 3 мл раствора HCI. Контрольную пробу титруют также до обесцвечивания.

Содержание остаточного азота рассчитывают по формуле:

(К - О) х 21,4 = ммоль/л, где К – количество тиосульфата, пошедшего на титрование контрольной пробы, О – на титрование опытной пробы, 21,4- коэффициент пересчета.

Нормальное содержание остаточного азота – 14,3 - 28,6 ммоль/л.

Диагностическое значение определения остаточного азота

Ретенционная (связанная с выведением) почечная гиперазотемия наблюдается при различных заболеваниях почек. Ретенционная непочечная гиперазотемия наблюдается при недостаточности кровообращения, травматическом шоке, опухолях мочевого пузыря.

Продукционная гиперазотемия сопровождается процессом усиления распада белка - при туберкулезе, диабете, тяжелом циррозе печени, при инфекционных заболеваниях, сопровождающихся лихорадкой. Понижение остаточного азота наблюдается при недостаточном питании, иногда – при беременности.

2. Определение билирубина в сыворотке крови.

Оборудование: 1. Штатив с пробирками.
  2. Пипетки на 1 мл и 2 мл.
  3. КФК.
  4. Кюветы на 0,5 см.
     
  Реактивы: 1. Кофеиновый реактив.
    2. 0,85% раствор NaCl.
    3. Диазореактив.
    4. Сыворотка крови.
           

Принцип метода. Связанный билирубин при взаимодействии с диазореактивом (диазофенилсульфоновая кислота) образует розовое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. Кофеиновый реактив переводит свободный билирубин в растворимое состояние, благодаря чему он также реагирует с диазореактивом, образуя розовое окрашивание. По интенсивности этого суммарного окрашивания определяют концентрацию общего билирубина. А концентрацию свободного билирубина определяют как разность между общим и связанным билирубином.

Ход работы. В 3 пробирки приливают реактивы по схеме:

Реактивы (мл) Общий билирубин Связанный билирубин Контрольная проба
Сыворотка 0,5 0,5 0,5
Кофеиновый реактив 1,75 ---- 1,75
0,85% раствор NaCl ---- 1,75 0,25
Диазореактив 0,25 0,25 ----

Через 5-10 мин после прибавления диазореактива колориметрируют пробу на связанный билирубин (при более длительном стоянии пробы в реакцию вступает несвязанный билирубин, что искажает результат). Пробу на общий билирубин колориметрируют через 20 мин после добавления диазореактива. Колориметрирование проводят при зеленом светофильтре в кювете толщиной 0,5 см против контроля. Концентрацию общего и связанного билирубина определяют по калибровочному графику.

Нормальное содержание билирубина в сыворотке: общий – 1,7-20,5 мкмоль/л, связанный – 0,86-4,3 мкмоль/л, свободный – 1,7-17,1 мкмоль/л.

Диагностическое значение определения билирубина сыворотки крови

Причины, вызывающие гипербилирубинемию, различны. Желтуха появляется, когда уровень билирубина в крови превышает 43 мкмоль/л. Заболевания, вызывающие повышение связанного билирубина: вирусный гепатит, цирроз печени, опухоль печени и метастазы, жировая дистрофия.

Заболевания, вызывающие повышение несвязанного билирубина: гемолитическая анемия, пернециозная анемия, желтуха новорожденных.

Наши рекомендации