Определение казеинолитической/ протеолитической активности супернатантов фекалий

Этот метод диагностики дисбиоза основаны на том, что различные таксономические виды бактерий, колонизирующие разные отделы кишечника, обладают неодинаковой протеолитической способностью. Как правило, индигенная микрофлора кишечника человека и его фекалий, в частности бифидо- и лактофлора, обладает выраженной сахаралитической, нежели протеолитической активностью. Возрастание суммарной протеолитической активности супернатантов фекалий тесно связано с увеличением количественного содержания многих видов условно-патогенных бактерий в кишечнике или с возрастанием доли бактерий, продуцирующих протеолитические энзимы, колонизирующих стенку кишечника.

Рисунок 15. Степени дисбактериоза на основании казеинолитической активности

Постановка:

1) Среда: в расплавленный МПА вносят 1,5% казеин на 0,2Н NaOH в соотношении 1:10, рН доводят до 7,2-7,4

2) Фекалии+ физ. р-р 1:10, цетрифугирование при 3000 об/мин 15 мин., обработать хлороформом

3) Вносят в лунки по 20 мкл

4) Инкубация при 37ºС 6-8ч

5) Проявление добавлением 5 мл 5% водного р-ра соляной кислоты

6) Оценка результата: 0 степень — менее 10 мм, 1 степень — от10 до 12 мм, 2 степень — от 13 до 16 мм, 3 степень — от 17 мм и более (рис.15)

Техники посева и питательные среды при исследовании на дисбактериоз

Рассев петлей (посев штрихами). Берут одну чашку Петри с питательным агаром и делят ее на 4 сектора, проводя разграничительные линии на внешней стороне дна чашки. Исследуемый ма­териал петлей вносят в первый сектор и проводят ею па­раллельные линии по всему сектору на расстоянии одна от другой около 5 мм. Этой же петлей, не изменяя ее положения по отношению к агару, проводят такие же линии на других секторах чашки. В том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост микроорганизмов будет в виде сплошного штриха. На секторах с небольшим количеством клеток вырастают отдельные колонии. Кроме того, можно наливать разведен­ные растворы смешанной культуры на поверхность твер­дых сред в чашках.

Таблица 21. Среды для микроорганизмов при диагностики дисбактериоза

Среды	Разведения	Микроорганизмы
Мюллера, селенитовая, магниевая	Без разведения	Патогенные энтеробактерии
Плоскирева, Левина с синтомицином	10-1
Печеночная среда Блаурока	10-3-10-10	Бифидумбактерии
Агар Хенеля (анаэробные условия)	10-3-10-7	Бактероиды
МРС-4 (анаэробные условия)	10-3-10-7	Лактобациллы и стрептококки
Среда Калины или ДИФ-3	10-3-10-7	Энтерококки
Желточно-солевой агар	10-3-10-5	Стафилококки
Среда Сабуро	10-3-10-5	Грибы рода Кандида
Среда Левина	10-3-10-5	Энтеробактерии
Среда Плоскирева	10-3	Энтеробактерии
Среда Эндо	10-5	Энтеробактерии
Малахитовый агар	10-1, 10-3, 10-5, 10-7	Синегнойная палочка
Кровяной агар	10-5, 10-7	Гемолизирующие культуры
Среда Вильсона-Блер	10-3, 10-5, 10-7	Клостридии

Схема 1. Схема посева на дисбактериоз по Gold:

A	I	II	III	Кол-во в 1 гр.
…	…	…	…	…
30-60	-	-	-
70-80	-	-	-
100-150	5-10	-	-
Не сосч.	20-30	-	-
Не сосч.	40-60	-	-	1 млн.
Не сосч.	100-150	10-20	-	5 млн.

Схема 2. Схема посева на дисбактериоз по Н.М.Грачевой, И.Н.Щетининой, 1991:

Схема посева на дисбактериоз по Дригальскому:

Схема 3. Схема посева на дисбактериоз по Дригальскому:

1. посев

шпателем

2. инкубация

3. учёт

трёхчашечный метод (по Дригальскому)

Рассев шпателем по Дригальскому. Берут 3 чашки Петри с питательной средой. На 1-ю чашку петлей или пипеткой наносят кап­лю исследуемого материала и растирают шпателем по всей поверхности питательного агара. Затем шпатель пе­реносят во 2-ю чашку и втирают оставшуюся на шпателе культуру в поверхность питательной среды. Далее шпа­тель переносят в 3-ю чашку и аналогичным образом про­изводят посев. На 1-й чашке вырастает максимальное количество колоний, на 3-й — минимальное. В зависимо­сти от содержания микробных клеток в исследуемом ма­териале на одной из чашек вырастают отдельные коло­нии, пригодные для выделения чистой культуры микро­организма.