Морфология и структура микроорганизмов
Микроорганизмы достаточно многообразны по морфологии, однако, с определенными натяжками их можно поделить на несколько групп:кокковидные, бактериевидные, вибриоспировидные, мицелиевидные, вирусовидные, протистовидные. Эти группы могут делиться на подгруппы. Различия морфологии микробов между этими группами и внутри их имеет определенное диагностическое значение.
Кокковидные. Это бактерии шаровидной формы. Скорости их размножения и расхождения клеток различны, что отражается на расположении кокков в мазках. Различают несколько разновидностей расположения кокковидных. Если бактерии быстро расходятся после деления и в силу этого располагаются в мазке в виде монококков (по отдельности), то их называют микрококки. Если кокки делятся в одной плоскости и недостаточно быстро расходятся, то в мазках они выглядят как диплококки, т.е. парные кокки. При меньшей скорости разделения бактерий образуются цепочки кокков, имеющие родовое название - стрептококки.
Если бактерии делятся в трех плоскостях и медленно расходятся, то в мазках с плотной агаровой среды они образуют характерные скопления в виде гроздьев винограда и имеют родовое название - стафилококки. Тетракокки образуются в результате деления в двух плоскостях и благодаря относительно не высокой скорости расхождения кокков - в мазках образуются четверки кокков по две пары. Сарцины - это кокки, которые расположены в мазках в виде пакетов или тюков, по 8, 16, 32 и более клеток, при делении родительской клетки сразу в нескольких плоскостях.
Среди кокковидных - стрептококков, стафилококков, диплококков имеется достаточно много видов бактерий, патогенных и условно-патогенных для человека. Например, вид Saphylococcus aureus вызывает у человека около 100 заболеваний - от юношеских угрей до перитонита, сепсиса и др. Диплококки - Neisseria gonorrhea вызывают у человека гонорею, а Neisseria meningitidis -менингит и др. Стрептококки вызывают гнойные поражения тканей - рожа, ревматизм и др.
Бактериевидные. Эти бактерии представлены цилиндрическими или палочковидными формами бактерий.
В 1875 г немецкий ботаник Г. Кон обнаружил у сенной палочки споры и стал именовать бактериевидные формы, образующие споры - бациллами, а культуры не образующие споры - бактериями. Образующие споры палочки, которые имеют веретенообразную форму, назвали клостридиями. По расположению клеток бактерий различают:диплобактерии - располагающиеся в мазках попарно и стрептобактерии - располагающиеся в виде цепочек. Бактериевидные различаются по длине, ширине, форме концов, расположению спор и пр. Некоторые бактерии окрашиваются по Цилю-Нильсену (микобактерии), а остальные - по Граму.
Среди бактериевидных следует особо выделить микоплазмы. Микоплазмы отличаются отсутствием клеточной стенки. Это мелкие, Грам (-) бактерии (0,12-0,25 нм), содержащие трехслойную ЦПМ. Они чувствительны к осмотическому давлению и нечувствительны к пенициллинам, ввиду отсутствия пептидогликана. Микоплазмы полиморфны. Имеют 92 вида, часть из них патогенны для человека.
Бактериевидные вызывают множество разнообразных заболеваний у человека:гнойно-воспалительные, дизентерию, сальмонеллезы, пневмонии, сибирскую язву, чуму, дифтерию, коклюш и др.
Вибриоспировидные. Это подвижные бактерии, имеющие извитую и спиралевидную формы. В мазках имеют несколько морфологических форм: извитые - четверть витка спирали, спириллы - в виде нескольких крупных завитков спирали, спирохеты - имеющие несколько мелких витков спирали. Извитые имеют один жгутик (Vibrio cholerae).
Таблица 8.
Морфологические признаки спирохет
| Род | Количество завитков | Характер движения | Окраска по Рома- новскому-Гимзе |
| Borrelia | 3-10 крупных, неравном. | толчкообразные, сгибате- льные, поступательные | сине-фиолетовые |
| Treponema | 8-14, среднекрупных | плавное, сгибательное, вращательное, поступательн. | бледно-розовые |
| Leptospira | Многочисленные первич- ные, S-образные, вторичн. | активное вращательно- поступательное | розово-сиреневые |
Спирохеты в зависимости от количества и формы завитков подразделяют на три формы:трепонемы – имеют до 14 средне-крупных завитков, лептоспиры - множество мелких завитков, боррелии – 3-10 крупных, неравномерных завитков.
Среди вибриоспировидных встречаются виды бактерий, проявляющие патогенные свойства в отношении людей: вызывая боррелиозы, лептоспирозы, сифилис, холеру и пр.
Вирусовидные. Это внутриклеточные генетические паразиты. Внеклеточную форму вирусов называют вирионом. Они имеют палочковидную или сферическую форму, проходят через бактериальные фильтры. Размеры варьируют от 15 до 500 нм. К вирусовидным относят разнообразные вирусы, в том числе – дефектные вирусы. Все вирусы делят на семейства и подсемейства и роды. Патогенные для человека и животных вирусы составляют 20 семейств. Вирусы делят на РНК и ДНК содержащие. Вирусы - это одна из мельчайших форм существования жизни. Они являются паразитами не только животного и растительного миров, но и микрофлоры, включая вирусы. На сегодня самая маленькая инфекционная частица - прион. Это белковая частица, которая не имеет генетического материала, но проявляет инфекционные свойства. Заболевания у человека и животных, вызываемые прионом, поражают мозг, с обязательным смертельным исходом.
Мицелиевидные. Это огромная группа, объединенная на основе общности многих признаков и образа жизни. Мицелий у микроорганизмов этой группы бывает воздушный и субстратный. Представители группы делятся на две неравноценные подгруппы: грибы и актиномицеты (таблица № 9).
Таблица 9
Морфологические признаки некоторых грибов
| Род | Мицелий | Споры | ||
| вегетативный | репродуктивный | тип | расположение | |
| Mucor | несептированный | спорангиеносец | эндоспоры | в спорангии |
| Aspergillus | септированный | конидиеносец | экзоспоры-конидии | в виде лейки |
| Penicillum | септированный | конидиеносец | то же | в виде кисточки |
Актиномицеты имеют вид длинных несептированных гиф, не образуют спор и жгутиков.
Грибы бывают низшие и высшие. Имеют дифференцированное ядро, способны к половому и бесполому видам размножения.
Среди этой группы имеются виды, патогенные для людей. Актиномицты вызывают у восприимчивых людей актиномикоз, а грибы - микозы.
Протистовидные. Это многочисленная группа одноклеточных микроорганизмов, распространенных в природе. Они могут быть шаровидной, овальной, сплюснутой или разветвленной формы, размером 5-20 мкм. Обычно подвижные и пластичные, образуют цисты в неблагоприятных условиях. Наиболее широко распространены жгутиконосцы, саркодовые, инфузории реснитчатые. Среди саркодовых имеются амебы раковинные и голые.
Протистовидные имеют виды, патогенные для человека, вызывая, например, амебную дизентерию.
Способ измерения микробной клетки
Микроскопические объекты измеряют в нанометрах (нм) или в микрометрах (мкм). В 1 мкм содержится 1000 нм, в 1 мм содержится 1000 мкм. Для измерения клеток применяют окуляр-микрометр и объект-микрометр. Окуляр-микрометр - это стеклянная пластинка в окуляре, на которой в центре нанесена шкала с 50 делениями. Объект-микрометр - это стекло, в центре которого находится шкала, поделенная на 100 частей. Обычно каждое деление шкалы содержит 10 мкм.
Объект-микрометр устанавливают на предметный столик, передвигая который винтами совмещают одно из делений с одним из делений окуляра-микрометра. Отмечают число делений объект-микрометра, в которые укладывается полное число делений окуляр-микрометра. Этим устанавливается величина делений окуляр-микрометра. Заменяют объект-микрометр на исследуемый препарат, размеры которого определяют линейкой окуляр-микрометра.
Структура микроорганизмов
Клетки микроорганизмов имеют внутренние и поверхностные структуры, среди которых различают обязательные и встречающиеся только у определенных групп микробов.
Строение бактериальной клетки. К внутренним широко распространенным структурам относят: цитоплазму, генофор, включения, рибосомы. К внешним обязательным структурам относят ЦПМ и клеточную стенку (за небольшим исключением). Необязательными для многих микроорганизмов внутренними структурами являются волютиновые зерна и спора, а внешними - капсула, жгутики, пили и пр.
Генофор или нуклеойд.Он содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) в форме свернутого кольца. ДНК называют хромосомой по аналогии с эукариотами. Генофор основной носитель генетической информации в клетке. Состоит из набора генов, которые расположены в определенном порядке. Кроме ДНК в клетке могут находится плазмиды и др. внехромосомные генетические структуры.
Цитоплазма.Это внутренняя среда клетки, в которой располагаются генофор (ДНК), рибосомы, полисомы, включения, ферменты, плазмиды.
Рибосомы состоят из РНК и белка. Они участвуют в процессе синтеза белка.
Гранулы содержат запасные вещества. Гранулы волютина окрашивают по Нейссеру.
Клеточная стенка. Это внешняя структура клетки, имеет неодинаковое строение у разных групп бактерий. В зависимости от строения клеточной стенки микроорганизмов, они могут окрашиваться как грамотрицательные или грамположительные. Это определяется количеством пептидогликана и других составных клеточной стенки.
Цитоплазматическая мембрана. Обязательный внешний элемент бактерий. Отделяет цитоплазму от клеточной стенки. Имеет трехслойную структуру. Это белково-липидный комплекс. ЦПМ полупроницаема и регулирует транспорт веществ в бактериальную клетку. Участвует в образовании мезосом. Это важный элемент клетки.
Споры.Это тельца сферической или эллипсойдной формы, устойчивые к воздействию неблагоприятных факторов, образуемые некоторыми бактериями. Их называют бациллами. Споры образуют такие роды как Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, отдельные кокки и спириллы. Спорообразование начинается, когда микробы испытывают недостаток в питательных веществах. Споры сохраняются в таких условиях, когда вегетативные клетки гибнут. В благоприятных условиях спора вновь может прорастать в вегетативную клетку, т.к. содержит генетический материал. Споры окрашивают по Ожешко.
Жгутики.Структурный элемент, предназначенный для движения бактерий в жидких средах. Бактерии могут иметь один жгутик и их называют монотрихии (Vibrio cholerae), один пучок жгутиков на одном конце - лофотрихии, по пучку жгутиков на обоих концах клетки - амфитрихии, множество жгутиков вокруг клетки - перетрихии. Жгутики окрашиваются по методу Леффлера.
Фимбрии.Внешний структурный элемент, короче и тоньше жгутиков, которые в большом количестве окружают клетку как "бахрома". Выполняют роль факторов адгезии, прикрепляясь к определенным рецепторам других клеток.
Пили.Внешний структурный элемент. В зависимости от функции и структуры, пили поделены на несколько типов. Пили 1, 3 и 4 типа функционируют как факторы адгезии. Более длинные пили, со структурой полого цилиндра, участвуют в переносе генетического материала от одной бактериальной клетке к другой.
Капсула.Является внешним структурным элементом. Это сложный комплекс таких соединеиий как полисахариды и полипептиды. Капсула не окрашивается анилиновыми красителями. Она не препятствует проникновению в клетку питательных веществ, являясь защитным слоем для клетки. Капсула препятствует фагоцитозу бактерий. Для обнаружения капсулы мазок окрашивают по комбинированному методу Гинса-Бури.
Вирусы.Это ультрамикроскопические облигатные внутриклеточные паразиты. Они были открыты в 1892 г Д.М. Ивановским. Вирусы содержат нуклеиновые кислоты одного из двух типов (ДНК или РНК). Нуклеиновая кислота окружена чехлом из белков, называемых капсидом.Структурный элемент, состоящий из белков и нуклеиновой кислоты, называют нуклеокапсид. Капсомеры - комплекс капсида и вирусного генома. Они скомпонованы по двум типам симметрии: сферической и спиралевидной. Некоторые вирусы на поверхности имеют шипы, образованные белками - гемагглютининами и нейраминидазой. Вирусы окрашивают по Морозову.
Актиномицеты. Клетки актиномицет имеют те же структурные элементы, что и бактерии: клеточную стенку, ЦПМ, в цитоплазме содержится нуклеойд, рибосомы и пр. элементы. Основным морфологическим признаком актиномицетов является ветвящаяся форма клеток, имеющих вид коротких палочек или длинных нитевидных образований, напоминающих мицелий грибов. Мицелий бывает у актиномицетов субстратным или воздушным.
Размножение актиномицетов происходит вегетативным путем (обрывками мицелия) и спорами. Спороносцы актиномицетов бывают волнистыми, прямыми и спиральными.
Среди актиномицетов встречаются сапрофитные и патогенные виды. Почвенные виды актиномицетов продуцируют многочисленные антибиотики.
Грибы.Имеют микро- и макроскопическое строение. Длинные нити - гифы, которые переплетаясь, образуют мицелий. Споры грибов располагаются внутри мицелия или внутри его. Плодоносящие гифы грибов Aspergillus и Penicillum называют конидиеносцами. Аскоспоры находятся в асках - сумках. Бластоспоры образуются в результате почкования клетки. Среди грибов различают высшие и низшие. Считают, что известных грибов более 500000 видов.
Питательные среды
Питательные среды - это искусственно приготовленный комплекс питательных веществ, предназначенный для культивирования микроорганизмов. Это искусственно приготовленная среда обитания микробов. Такие питательные среды обычно готовят на определенной основе (агар, мясо-пептонный бульон и пр.), с учетом пищевых потребностей культивируемых на них микробов. Они бывают простого и сложного состава и готовятся для лабораторных или промышленных целей.
Питательные среды должны:
1. Содержать в нужном количестве весь набор элементов, которые предназначены для восполнения структуры микроорганизмов. Они должны быть в усвояемых химических соединениях:многоатомные спирты, углеводы, органические кислоты и пр. - это источники углерода; аммонийные соединения, аминокислоты, белки, пептиды - источники азота;соли фосфорной и др. кислот - источники микроэлементов;витамины и др. - факторы роста,а также должны содержать соли, воду.
2.Иметь оптимальную: влажность (не мене 20 % воды), вязкость, рН среды (диапазон от 4,5 до 8,5), изотоничность (для большинства - 0,85 %, для голофилов - 3 %), окислительно-восстановительный потенциал Rh (для анаэробов 0,120-0,060, для аэробов более 0,90).
3. Питательная среда должна быть прозрачной.
4. Питательная среда должна быть стерильной.
Питательные среды по консистенции могут быть жидкие и полужидкие (0,3-0,7 % агара) и плотные (1,5-2,0 % агара).
Для приготовления питательных сред применяют естественные продукты животного, яичного, рыбного и растительного происхождения или искусственные ингредиенты в строго определенных количествах и такие среды называют синтетическими, а при добавлении к ним еще и естественных продуктов - полусинтетическими. Питательные среды из естественных продуктов имеют неопределенный химический состав и требуют добавок некоторых веществ - ингибиторов посторонней флоры и пр. В состав питательных сред на синтетической основе входят аминокислоты, витамины, минеральные соли и др. известные химические элементы в известных количествах. В полусинтетические среды кроме известных элементов входят пептон, дрожжевой экстракт и др. вещества.
Питательные среды по назначению бывают: консервирующие, обогащения, элективно-диагностические, универсальные и дифференциально-диагностические.
Консервирующие или транспортные среды предназначены для транспортировки в баклабораторию материала первично засеянного у постели больного.
Универсальные среды предназначены для роста неприхотливых микробов или добавки таких сред как основы к более сложным.
Среды обогащения предназначены для накопления одних микробов при подавлении роста других, что бывает очень важным, т.к. первичный материал часто засевают на твердые среды и обогащения одновременно.
Элективно-диагностические среды предназначены для первичного выделения групп или родов микроорганизма с целью последующей дифференцировки и идентификации на других средах.
Дифференциально-диагностические среды предназначены для окончательного ответа о виде и подвиде выделенной чистой культуры.
Элективность диагностических сред выделения бактерий достигается за счет добавления в их состав определенных ингибиторов для других видов микроорганизмов (желчь, азид натрия, теллурит калия, рН, соль, антибиотики и др. вещества). Проводимая далее с чистой культурой дифференциальная диагностика бактерий основана на определении особенностей, например, биохимических и др., путем внесения в среду определенных субстратов (сорбита, мальтозы, сахарозы и др. - это углеводы; орнитина, лизина, аргинина и др. – это белки; солей, мочевины и пр.).
В настоящее время на разные группы микробов выпускают в стране и за рубежом тесты нескольких поколений и порядков: 1-порядка - тест-система, расфасованная по лункам полистироловых пластин питательная среда (АР1-20E, Eneroes, MMТE1 и др.). 2-порядка - системы в бумажном индикаторном исполнении (Micro-10, M:N:ТEK и др.), 3 -порядка - тест-система жидкая, приготовленная ex тempore.
Приготовление питательных сред
Ввиду множества прописей приготовления питательных сред, в этом разделе приводим примеры приготовления наиболее распространенных из питательных сред.
Компоненты для питательных сред. Натуральные питательные среды целиком состоят из животного сырья (свернутая сыворотка, кровь и др.) или с наполнителем (агар, пептон, желатин и др.). Для питательных сред используют:картофель,кровь, молоко, яйца, рыбную муку, дрожжи и пр. и готовят из них экстракты и настои (полуфабрикаты, гидролизаты и перевары, например, Хоттингера) и пр. Это источники белковых, азотистых и др. веществ. В качестве минеральных солей используют:NaCI, KHPO4, MgSO4 и др. В качестве сахара – глюкозу либо лактозу, мальтозу, сахарозу и пр. Из индикаторов применяют Андреде (0,5 г кислый фуксин, 1N NaOH 17 мл, дистиллированная вода до 100 мл), Кларка (1,5 % раствора фенолового красного, метиленового красного, бромтимолового синего и др.), а также нужно использовать аминокислоты, витамины и др. ингредиенты.
Для искусственных сред применяют определенные элементы в строго известных дозах, которые оптимальны для конкретных микроорганизмов.
Некоторые рецепты приготовления питательных сред:
Транспортные среды
1. Среда с теллуритом калия. Агаровую основу 0,1 % разливают в пробирки по 4 мл. Стерилизуют при 1 атм 20 мин. В каждую пробирку по правилам асептики вносят 0,5-1,0 мл сыворотки КРС и по 0,05 мл 2 % раствора теллурита калия. Срок хранения 10 дней.
2. Среда Тига (глицериновая смесь). Смешивают 1 л глицерина и 2 л 0,85 % раствора хлорида натрия и 15-20 % раствора фосфата натрия в количестве, чтобы рН был 7,8-8,0. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд или 20 мин при 0,5 атм.
3. Глицериновый консервант. Это разновидность глицериновой смеси, с содержанием солей лития.
Среды обогащения
1. Селенитовая среда. Смешивают пептон- 0,5 г, селенистокислого натрия - 0,4 г, фосфата натрия однозамещенного - 0,7 г, фосфорнокислого двузамещенного натрия - 0,7 г, лактозы - 0,4 г, дистиллированной воды - до 100 мл. Разливают по пробиркам и флаконам, стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.
2. Среда Мюллера. В стерильные флаконы отвешивают 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром, наливают 90 мл бульона и стерилизуют 30 мин при 1 атм. К каждому флакону в асептических условиях добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора гупосульфита натрия.
3. Раствор Люголя:дистиллированная вода 20 мл, йодида калия 20 г, йода 25 г. После растворения доливают дистиллированной воды до 100 мл. Раствор гипосульфита натрия:в мерный цилиндр насыпают 50 г гипосульфита натрия и добавляют дистиллированной воды до 100 мл, перемешивают, переливают в бутыль, стерилизуют текучим паром.
Универсальные среды.
1. Мясо-пептонный бульон.
а) Приготовление мясного экстракта:
500 г мяса (без костей, жира и сухожилий) разрезают на мелкие кусочки (пропускают через мясорубку), заливают 1 л водопроводной воды. Выдерживают сутки в холодильнике или 2 ч в термостате при 370 С. Отжимают мясо через марлю, кипятят на огне 5 мин и дают остыть. Фильтруют через ватный фильтр, доливают водой до первоначального объема
б) Приготовление мясопептонного бульона:
В 1 л мясной воды растворяют при подогревании и помешивании 10 г (1 %) пептона и 5 г (0,5 %) поваренной соли. Устанавливают слабощелочную реакцию 10 % раствором соды с помощью лакмуса (красная лакмусовая бумага слегка синеет). Кипятят 30-40 мин на огне. Дают остыть, фильтруют через бумажный фильтр и доливают водой до первоначального объема. Определяют концентрацию водородных ионов калориметрическим путем - в компараторах, подправляют рН 10 % раствором щелочи или уксусной кислоты. Кипятят, остужают, фильтруют, разливают по 5-6 мл в пробирки и по 50-100 мл в колбы, стерилизуют до 20 мин в автоклаве при 120о С.
2. Приготовление мясопептонного агара:
К бульону прибавляют 2- 3 % измельченного агара, нагревают до растворения агара, остужают агар до 500 С. Для осветления вносят белок 1 куриного яйца, смешивают его с двойным объемом холодной воды и вносят в агар, автоклавируют 45 мин при 1150 С для осаждения хлопьев белка. Фильтруют агар еще не остывший, разливают в стеклянную посуду. Вновь стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1200 С. Готовят скошенный или прямой агар, остужая пробирки (флаконы, колбы) до застывания агара.
3. Приготовление перевара (гидролизат) Хоттингера:
а) Мясо (1 кг) нарезают кусочками, добавляют двойной объем воды и кипятят 15-20 мин, извлекают, пропускают через мясорубку и опускают снова в тот же бульон, подщелочив его до рН 8,0. Охлаждают до 400 С, добавляют поджелудочную железу, пропущенную через мясорубку, в объем 100 г на 1 л воды.
б) Фарш перемешивают, подщелачивают, переливают в бутыль с плотной резиновой пробкой, оставляют треть бутылки свободной. Вносят 1-3 % хлороформа, закрывают бутыль, встряхивают, открывают бутыль на 1 мин для выпускания хлороформа
в) Проверяют рН (через 1 ч после добавления фермента) и подщелачивают до рН 7,4-7,6. Смесь оставляют на 10-16 дней при комнатной температуре. Первые дни подщелачивают и встряхивают. За несколько дней до окончания экспозиции бутыль не встряхивать.
г) Правильный перевар будет иметь пылевидный осадок и соломенно-желтый раствор. Содержание азота 11,00-12,00 г на 1 л. Перевар фильтруют через полотнянный фильтр или бумажный, разливают в бутыли и колбы и стерилизуют в течение 30 мин при 1200 С.
4. Приготовление бульона Хоттингера:
К 100 мл перевара Хоттингера добавляют 800 мл дистиллированной воды, вносят 5 г хлористого натрия, 0,2 г однозамещенного фосфорнокислого натрия, устанавливают рН 7,4-7,6. Разливают в колбы и пробирки. Стерилизуют в течение 20 мин при 1200 С. Содержание аминного азота - 1,00-1,20 г на 1 л.
5.Приготовление агара Хоттингера:
К 1 л бульона Хоттингера в колбе объемом 2-3- л прибавляют 18-25 г мелко нарезанного агара (1,5-2,0 %). Будьон кипятят, постоянно его перемешивая, до расплавления агара. Устанавливают рН 7,4-7,6 . Расплавленный агар фильтруют через несколько слоев марли и разливают в колбы и пробирки. Посуду расставляют в специальную тару и стерилизуют в течение 20 мин при 1200 С в стерилизаторе. Затем стерильный агар в посуде используют для посева микроорганизмов или расплавляют, разливают в более мелкую посуду и вновь стерилизуют.