Методы определения Mr белков

У большого числа белков химический состав и последовательность аминокислот не установлена (10¹⁰–10¹² белков), поэтому у таких белков определяют Mr. При этом используются различные методы.

а) Седиментационный метод – определение Mr проводят в специальных центрифугах (первая центрифуга была предложена шведским биохимиком Сведбергом), в которых удается создать центробежное ускорение, которое больше в 200 тыс. и более раз ускорения земного притяжения. Mr определяют по V седиментации молекул. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница белок-растворитель. Скорость седиментации выражают через константу седиментации (S):

где V – скорость перемещения границы белок-растворитель (см/с);

w – угловая скорость ротора (рад/с);

i – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белков (см).

Величина константы седиментации S, которая равна 1´10^–13 С условно принята за 1 и называется 1 Сведбергом (S). S для белков лежит в пределах 1-50 S, иногда до 100 S.

Mr белков определяется по уравнению Сведберга:

где R – универсальная газовая постоянная;

Т – абсолютная температура по Кельвину;

S – константа седиментации;

Д – коэффициент диффузии;

r – плотность растворителя;

V – парциальный удельный объем газа.

Этот метод дорогостоящий из-за применения аппаратуры.

Более просты и дешевы:

б) Гель-фильтрация в тонком слое сефадекса.

Длина пробега белка (в мм) находится в логарифмической зависимости от Mr. Х – Mr искомого белка на калибровочном графике.

в) Диск-электрофорез в полиакриламидном слое – также существует зависимость между логарифмом Mr калибровочных белков и длиной их пробега.

Методы определения гомогенности белков

Степень чистоты выделенного белка определяется:

ü ультрацентрифугированием;

ü методом диск - электрофореза;

ü различными иммунохимическими методами;

ü определением растворимости белка (метод Нортропа) основан на правиле фаз, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от концентрации вещества в твердой фазе.

Если белок гомогенный, то на графике получается один перегиб (а), если есть примеси белков (б, в), то получим несколько перегибов кривой насыщения. У всех белков свои индивидуальные кривые растворимости.

ЛЕКЦИЯ 4

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

В 1868 г. швейцарский ученый Ф. Мишер выделил из ядер лейкоцитов вещество, названное им нуклеином (от греч. nucleus – ядро). В 20-м столетии стало известно химическое строение нуклеина – его назвали ДНК. Позднее открыли и РНК. Мишер определил, что нуклеин содержит большое количество Р, нуклеин обладал выраженными кислыми свойствами. К середине 20 в. было обнаружено, что нуклеиновые кислоты в организме находятся в комплексе с белками, то есть в виде нуклеопротеидов и участвуют в передаче наследственных признаков.