Цитоплазматические включения

У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включениями. Среди них – отложения жира, поли-b-гидрооксимасляной кислоты, полифосфатов, полисахаридов, серы и различных кристаллов. Для выявления этих включений, которые сильно преломляют свет, применяется несколько методов.

Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans, Bacillus subtilis, а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Гранулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются различными красителями, изменяя цвет последних.

Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в ярко-красный цвет. Такое явление получило название метахромазии. Гранулы волютина представлены полифосфатами – запасающимся веществом, которое служит источником фосфатных групп.

Окраска гранул волютина по Нейссеру.

Методика окрашивания.

1 На фиксированный мазок наносят 2 – 3 капли раствора метиленового синего по Нейссеру и окрашивают в течение 1 – 2 мин.

2 Краситель сливают, препарат промывают водой.

3 Мазок обрабатывают раствором Люголя в течение 20 – 30 с.

4 Не промывая препарат водой, мазок дополнительно окрашивают 2 – 3 мин 2 % раствором везувина (или хризоидина).

5 Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют, используя иммерсионную систему. Цитоплазма окрашивается в желтый цвет, а гранулы волютина – в темно-синий.

Подвижность бактерий

Поступательное движение бактерий за счет жгутиков можно наблюдать во влажных препаратах, применяя в большинстве случаев светлопольный микроскоп. Наиболее эффективно наблюдение за подвижностью в темнопольном микроскопе.

На основании количества и характера расположения жгутиков на поверхности бактериальной клетки отнесите ее к одному из следующих типов: монотрихи (имеют только один жгутик, прикрепленный к одному полюсу клетки), лофотрихи (на одном из своих полюсов имеют пучок из 2-50 жгутиков), амфитрихи (пучки жгутиков имеются на каждом из полюсов бактериальной клетки), перитрихи (многочисленные жгутики расположены по всей поверхности клетки).

Чтобы убедиться, что жгутики действительно присущи данным микроорганизмам, а также определить их расположение (полярное, перитрихиальное, латеральное), требуются методы с применением окрашивания.

Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO₄)₂, HgCl₂) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Одним из предложенных методов окрашивания жгутиков является метод Лейфзона.

Методика окрашивания.

1 Выращенные на скошенном агаре бактерии, осторожно ресуспендируют в пептонной воде. Бактериальной петлей суспензию наносят на предметное стекло и высушивают на воздухе.

2 Восковым стеклографом очерчивают вокруг бактериальной пленки прямоугольник.

3 Наносят на предметное стекло 1 мл раствора красителя таким образом, чтобы он не вытекал за пределы восковой линии. Оставляют краситель на определенное время (до 1 часа). В состав красителя входят 1,5 % хлористого натрия, 3 % таннина (дубильной кислоты) и 0,03 % фуксина.

4 Как только на поверхности красителя образуется золотистая пленка, а по всему мазку выпадет осадок, краситель удаляют под струей воды, а препарат высушивают на воздухе.

5 Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки.

Подвижность бактерий может быть выявлена с использованием техники посева в столбик агара. При этом культуру бактерий засевают уколом в столбик 0,3 % питательной среды в пробирке. Пробирки помещают в термостат для инкубирования. Результаты учитывают через 24 – 48 часов. Подвижные бактерии растут по всей толще агара, вызывая диффузное помутнение среды, неподвижные – только по линии укола.

Задание к лабораторной работе

1 Выявить наличие капсул бактерий при помощи метода Гинса – Бурри (метод негативного контрастирования).

2 Методом Шефера – Фултона изучить наличие и расположение эндоспор бактерий.

3 Цитоплазматические включения гранул волютина изучить методом окраски по Нейссеру.

4 Методом Лейфзона выявить наличие жгутиков на теле бактерий. На основании количества и характера расположения жгутиков на поверхности бактериальной клетки определить ее тип.

5 Результаты опытов зарисовать, сделать выводы.

Вопросы к защите лабораторной работы

1 Строение бактериальной клетки.

2 Цитоплазматические включения. Химический состав, назначение, способы окраски.

3 Перечислите органоиды, которые можно отнести к необязательным органоидам бактериальной клетки. Назовите их химический состав, функции.

4 Капсула бактерий. Химический состав, функции, способы окраски.

5 Типы передвижения бактериальных клеток. Способы окраски жгутиков.